高剂量叶酸治疗自闭症儿童的安全性和有效性：叶酸代谢基因多态性的影响
蔡云张 1,2,†，陈艳林 3,†，侯芳 3，李艳芝 1,2，王万欣 1,2，郭兰 1,2，张彩霞 1,2，李丽 3,
，陆慈勇 1,2,
1 中山大学公共卫生学院医学统计与流行病学系，广州 510275，中国；
zhangcy28@mail2.sysu.edu.cn（C.Z.）；
liyzh96@mail2.sysu.edu.cn（Y.L.）；
wangwx65@mail.sysu.edu.cn（W.W.）；
guolan3@mail.sysu.edu.cn（L.G.）；
zhangcx3@mail.sysu.edu.cn（C.Z.）
2 中山大学广东省食品营养与健康重点实验室，广州 510275，中国
3 深圳市罗湖区妇幼保健院小儿神经康复科，深圳 518019，中国；
ningxinyilin@126.com（Y.C.）；
houfang@alumni.hust.edu.cn（F.H.）
·
通讯作者：2002515130001@alumni.hust.edu.cn（L.L.）；
luciyong@mail.sysu.edu.cn（C.L.）；电话：+86-13480173260（L.L.）；+86-13610355985（C.L.）
† 这些作者对本工作贡献相同。
学术编辑：Edward Quadros
接收日期：2025 年 4 月 3 日
修订日期：2025 年 5 月 4 日
接受日期：2025 年 5 月 5 日
发布日期：2025 年 5 月 7 日
引用：Zhang, C.; Chen, Y.; Hou, F.; Li, Y.; Wang, W.; Guo, L.; Zhang, C.; Li, L.; Lu, C. 高剂量亚叶酸在自闭症儿童中的安全性和有效性：叶酸代谢基因多态性的影响。《营养素》2025, 17, 1602.
https://doi.org/10.3390/nu17091602
摘要：
背景 / 目的：关于高剂量叶酸在中国自闭症谱系障碍（ASD）儿童中的安全性和有效性的研究有限，且叶酸代谢基因多态性对其疗效的影响尚不清楚。本试验旨在评估高剂量叶酸干预在中国自闭症儿童中的安全性和有效性，并探讨叶酸代谢基因多态性与疗效之间的关联。
方法：进行了一项为期 12 周的随机临床试验，包括 80 名符合条件的自闭症儿童，随机分配至干预组（n=50）或对照组（n=30）。干预组接受了叶酸（2 mg/kg/ 天，最大 50 mg/day）的分两次给药。疗效通过《心理教育档案》第三版（PEP-3）在基线和 12 周时由两位不知晓分组情况的受训专业人士评估。干预组中的甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR C677T，MTHFR A1298C）、蛋氨酸合成酶（MTR A2756G）和蛋氨酸合成酶还原酶（MTRR A66G）采用金标准方法进行了基因分型。
结果：干预组有 49 名参与者，对照组有 27 名参与者完成了这项试验。两组在大多数结果指标上都从基线到 12 周有所改善。干预组在社会互惠方面的改善显著优于对照组。携带 MTHFR A1298C 或 MTRR A66G 突变的儿童在多个发育领域表现出比野生型更大的改善。叶酸在某些基因型组合中可能更有效，例如 MTHFR C677T 和 A1298C。干预期间未观察到显著的不良反应。
结论：高剂量叶酸可能是 ASD 儿童的一种有前景的干预措施，其疗效与叶酸代谢基因多态性有关。高剂量叶酸干预可能通过缓解单个或联合突变引起的叶酸代谢异常，促进更好的神经发育结局。
关键词：自闭症；叶酸；安全性；有效性；叶酸代谢基因多态性
1. 介绍自闭症谱系障碍（ASD）是一种复杂的神经发育障碍，其特征是沟通和社交互动受损、兴趣受限以及重复刻板的行为 [1]。自闭症的患病率在全球范围内呈上升趋势，大约每 54 名儿童中就有 1 人患有此病 [2,3]。自闭症患者需要终身持续的医疗和社会支持，这给受影响的家庭和医疗系统带来了沉重的负担 [4,5]。尽管进行了广泛的研究，但目前仍没有批准用于治疗自闭症核心症状或潜在病理生理异常的药物 [6]。因此，迫切需要探索针对自闭症潜在生化异常的有效干预措施。
许多研究表明，ASD 最有希望的可治疗病理生理学靶点之一是叶酸代谢异常 [6,7,8]。正常的叶酸代谢对一碳代谢和正常神经系统发育至关重要。叶酸（又称亮氨酸），是叶酸的一种还原形式，最近因其作为自闭症谱系障碍儿童潜在药物干预手段而受到关注。叶酸可以直接进入叶酸循环，无需通过二氢叶酸还原酶进行还原，从而有效恢复正常依赖叶酸的一碳代谢，纠正甲基化和转硫化途径中的异常，并减轻氧化应激和炎症反应 [11-13]。多项临床试验表明，高剂量叶酸补充可以缓解自闭症特征，特别是在语言表达、沟通和社会互动方面 [11,14-16]。尽管叶酸干预显示出作为治疗策略缓解自闭症特征的潜力，但迄今为止大多数研究主要集中在西方人群中，需要进一步的研究来填补中国自闭症谱系障碍儿童这一领域的空白 [9]。
值得注意的是，叶酸干预的疗效可能受到与 ASD 相关的叶酸代谢基因多态性的影响 [17,18]。甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T 和 A1298C、蛋氨酸合成酶（MTR）A2756G 以及蛋氨酸合成酶还原酶（MTRR）A66G 是叶酸代谢途径中最常研究的多态性，已被证明会影响酶活性和正常的叶酸代谢 [9,11,12,17,19,20]。MTHFR 活性的降低会导致 5,10 - 亚甲基四氢叶酸向 5 - 甲基四氢叶酸的转化受阻，而后者是叶酸的生物活性形式，从而减少体内可利用的叶酸池 [21]。同样，MTR 和 MTRR 活性的降低可能阻碍同型半胱氨酸向蛋氨酸的再甲基化，导致同型半胱氨酸积累和 S - 腺苷蛋氨酸的减少，后者是 DNA 甲基化和其他细胞甲基化反应的关键甲基供体 [21]。高剂量叶酸补充可以为叶酸循环提供足够的底物，改善由 MTHFR、MTR 或 MTRR 活性降低引起的叶酸代谢异常 [22-24]。此外，研究表明，MTHFR C677T 和 A1298C 多态性的表型效应受叶酸水平的影响 [24,25]。孕期补充叶酸与携带 MTHFR C677T 突变的后代患自闭症谱系障碍的风险降低有关。然而，关于叶酸代谢基因多态性与叶酸干预效果之间关联的研究有限。了解叶酸代谢基因多态性与干预效果之间的关系对于优化自闭症谱系障碍的叶酸治疗以及识别最有可能受益的亚群至关重要。
因此，这项为期 12 周的随机临床试验旨在：
（1）评估高剂量叶酸干预（2 毫克 / 千克 / 天，最大 50 毫克 / 天）在中国自闭症谱系障碍儿童中的安全性和有效性；
（2）探讨叶酸代谢基因多态性（MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTR A2756G 和 MTRR A66G）与疗效之间的关联。
本研究有助于阐明叶酸补充剂的潜在益处，为自闭症儿童的发展结果提供了重要的遗传基础，并为个性化营养干预提供了重要基础，这有助于为这一人群制定精确的医学策略。
2. 材料和方法2.1. 参与者和研究设计这项随机临床试验于 2021 年 8 月至 2023 年 8 月在中国深圳市罗湖区妇幼保健院进行。80 名符合条件的参与者被随机分配到干预组（n=50）或对照组（n=30）。疗效评估在基线时和 12 周干预结束时进行。纳入标准为年龄在 3 至 6 岁之间，由两位专科医生根据《精神障碍诊断与统计手册》第五版（DSM-5）中的标准诊断为自闭症谱系障碍的儿童。排除标准包括存在严重的胃肠道症状、先天性心脏病、肝肾疾病、癫痫、脑畸形、服用抗精神病药物以及既往或当前使用叶酸相关药物或任何已知影响叶酸代谢的药物（如维生素或矿物质补充剂）。此外，患有线粒体疾病、其他遗传代谢障碍和严重精神或神经疾病的参与者也被排除。所有参与者的法定监护人在入组前均签署了知情同意书。研究期间有四名参与者失访，其中对照组三人（两人因家长撤回同意，一人因搬家），干预组一人（因家长撤回同意）。本研究的详细流程图见图 1。
2.2. 干预干预组的参与者每天口服 2 毫克 / 千克（每日最大剂量为 50 毫克）的叶酸（广东岭南制药有限公司，韶关，中国），分为两次服用，每次间隔 6 到 8 小时，持续 12 周。叶酸的剂量基于先前发表的双盲、安慰剂对照随机临床试验的结果，这些试验证明了其在自闭症谱系障碍儿童中的有效性和安全性。叶酸剂量超过 5 mg/day 通常被归类为高剂量 [27]。叶酸可以直接吞服，也可以碾碎后与食物或饮料混合以方便食用。通过收集家长反馈和在整个研究期间进行药丸计数来监测干预的依从性。
此外，干预组和对照组都接受了为期 12 周的综合康复教育干预，该干预基于治疗和教育自闭症及相关沟通障碍儿童（TEACCH）框架。TEACCH 构建了一个多维度的治疗和教育项目，专为自闭症谱系障碍儿童设计，采用个性化和结构化的教学策略，以增强认知功能、社交沟通能力和适应行为 [28]。该项目通过半天的课堂培训模式实施，整合了七个核心模块：（1）结构化教学，（2）音乐疗法，（3）艺术活动，（4）语言和认知训练，（5）互动社交游戏，（6）日常生活技能发展，以及（7）感觉统合治疗。
2.3. 结果测量本研究使用《心理教育档案》第三版（PEP-3）评估了叶酸干预的效果。PEP-3 是一种成熟的工具，用于评估自闭症谱系障碍的干预效果，能够更准确、全面地评估和监测 6 个月至 7 岁自闭症儿童的发展情况 [29,30]。PEP-3 包含 172 个项目，分为 10 个子测试，其中包括三个关于沟通能力的综合测试、三个关于运动能力的综合测试以及四个关于适应不良行为的综合测试 [29]。评估由两位独立的专业人士进行，他们未参与研究，对分组不知情，但接受过 PEP-3 的专项培训和经验。在此评估中，较低的原始分数表示更高的自闭特质水平。基线时和 12 周干预后的 PEP-3 克隆巴赫 α 系数分别为 0.96 和 0.97。
2.4. 不良反应治疗后出现的症状量表（TESS）用于监测高剂量叶酸补充剂的不良反应 [31]。如果参与者的监护人撤回同意，或他们在干预期间出现不良反应，如睡眠困难、失眠、多动、烦躁或异常神经检查结果，参与者将被退出研究。
2.5. 基因分型基因分型采用聚合酶链反应（PCR）和桑格测序技术，针对干预组中的 MTHFR C677T（A222V，rs1801133）、MTHFR A1298C（E429A，rs1801131）、MTR A2756G（D919G，rs1805087）和 MTRR A66G（I22M，rs1801394）进行 [19,32]。该方法因其高可靠性和准确性而被视为金标准 [33]。在基线时采集受试者的外周血样本，使用磁性通用基因组 DNA 试剂盒 (DP705，天根生化科技有限公司，北京，中国）提取基因组 DNA。引物使用 Primer Premier 5.0 设计，并由上海迈普生物科技有限公司（上海，中国）合成。
PCR 扩增反应体系和 PCR 程序设置见补充材料，表 S1 和 S2。PCR 产物使用 E.Z.N.A. 凝胶提取试剂盒 (D2500-01，Omega Bio-Tek，美国佐治亚州诺克罗斯）按照制造商的说明进行纯化。测序在 ABI 3730XL 测序仪上进行，使用荧光标记的双脱氧核苷酸生成色谱图，分析以确定基因型。用于叶酸代谢基因分型的引物序列和 PCR 产物长度，以及分型结果总结见补充材料...
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自闭症儿童高剂量亚叶酸治疗的安全性和有效性：叶酸代谢基因多态性的影响蔡云张 1,2,†，陈艳林 3,†，侯芳 3，李艳芝 1,2，王万欣 1,2，郭兰 1,2，张彩霞 1,2，李丽 3,，陆慈勇 1,2,
摘要：
背景 / 目的：关于高剂量亚叶酸在中国自闭症谱系障碍（ASD）儿童中的安全性和有效性研究有限，且叶酸代谢基因多态性对其疗效的影响尚不明确。本试验旨在评估高剂量亚叶酸干预在中国自闭症儿童中的安全性和有效性，并探讨叶酸代谢基因多态性与疗效的关联。
方法：开展一项为期 12 周的随机临床试验，纳入 80 名符合条件的自闭症儿童，随机分配至干预组（n=50）或对照组（n=30）。干预组接受亚叶酸（2 mg/kg/ 天，最大 50 mg / 天）分两次口服。疗效通过《心理教育档案》第三版（PEP-3）在基线和 12 周时由两名对分组不知情的专业人员评估。干预组中甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR C677T、MTHFR A1298C）、蛋氨酸合成酶（MTR A2756G）和蛋氨酸合成酶还原酶（MTRR A66G）基因多态性采用金标准方法进行基因分型。
结果：干预组 49 名、对照组 27 名参与者完成试验。两组在大多数结局指标上均从基线到 12 周有所改善。干预组在社会互惠方面的改善显著优于对照组。携带 MTHFR A1298C 或 MTRR A66G 突变的儿童在多个发育领域的改善优于野生型。亚叶酸在某些基因型组合（如 MTHFR C677T 和 A1298C）中可能更有效。干预期间未观察到显著不良反应。
结论：高剂量亚叶酸可能是 ASD 儿童的一种有前景的干预措施，其疗效与叶酸代谢基因多态性相关。高剂量亚叶酸干预可能通过缓解单个或联合突变引起的叶酸代谢异常，促进更好的神经发育结局。
关键词：自闭症；亚叶酸；安全性；有效性；叶酸代谢基因多态性
1. 引言自闭症谱系障碍（ASD）是一种复杂的神经发育障碍，特征为沟通和社交互动受损、兴趣受限及重复刻板行为 [1]。全球 ASD 患病率呈上升趋势，约每 54 名儿童中 1 人患病 [2,3]。ASD 患者需要终身医疗和社会支持，给家庭和医疗系统带来沉重负担 [4,5]。尽管研究广泛，但目前尚无批准用于治疗 ASD 核心症状或潜在病理生理异常的药物 [6]。因此，迫切需要探索针对 ASD 潜在生化异常的有效干预措施。
多项研究表明，ASD 最有希望的可治疗病理生理学靶点之一是叶酸代谢异常 [6,7]。正常叶酸代谢对一碳代谢和神经系统发育至关重要。亚叶酸（又称甲酰四氢叶酸）作为叶酸的还原形式，近年作为 ASD 儿童潜在药物干预手段受到关注。亚叶酸可直接进入叶酸循环，无需二氢叶酸还原酶还原，从而有效恢复叶酸依赖的一碳代谢，纠正甲基化和转硫化途径异常，减轻氧化应激和炎症反应 [11-13]。多项临床试验显示，高剂量亚叶酸补充可缓解自闭症特征，尤其在语言表达、沟通和社交互动方面 [11,14-16]。然而，多数研究集中于西方人群，中国 ASD 儿童的相关研究亟待填补 [9]。
值得注意的是，亚叶酸干预疗效可能受 ASD 相关叶酸代谢基因多态性影响 [17,18]。甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T 和 A1298C、蛋氨酸合成酶（MTR）A2756G 及蛋氨酸合成酶还原酶（MTRR）A66G 是叶酸代谢途径中研究最多的多态性，已证实影响酶活性和正常叶酸代谢 [9,11,12,17,19,20]。MTHFR 活性降低导致 5,10 - 亚甲基四氢叶酸向生物活性形式 5 - 甲基四氢叶酸转化受阻，减少体内可用叶酸池 [21]。类似地，MTR 和 MTRR 活性降低阻碍同型半胱氨酸再甲基化为蛋氨酸，导致同型半胱氨酸积累和 S - 腺苷蛋氨酸减少（后者是 DNA 甲基化关键甲基供体）[21]。高剂量亚叶酸补充可为叶酸循环提供足够底物，改善由上述酶活性降低引起的叶酸代谢异常 [22-24]。此外，MTHFR C677T 和 A1298C 多态性的表型效应受叶酸水平影响 [24,25]。孕期补充叶酸与携带 MTHFR C677T 突变后代 ASD 风险降低相关 [23,26]。但叶酸代谢基因多态性与亚叶酸干预疗效关联的研究有限，明确两者关系对优化 ASD 叶酸治疗及识别获益亚群至关重要。
因此，本 12 周随机临床试验旨在：
（1）评估高剂量亚叶酸干预（2 mg/kg/ 天，最大 50 mg / 天）在中国 ASD 儿童中的安全性和有效性；
（2）探讨叶酸代谢基因多态性（MTHFR C677T、A1298C、MTR A2756G、MTRR A66G）与疗效的关联。
本研究有助于阐明亚叶酸补充对自闭症儿童发育结局的潜在益处，为个性化营养干预提供重要遗传基础，助力该人群精准医疗策略的制定。
2. 材料与方法2.1. 研究对象与设计本随机临床试验于 2021 年 8 月至 2023 年 8 月在深圳市罗湖区妇幼保健院开展。80 名符合条件的参与者随机分配至干预组（n=50）或对照组（n=30）。疗效评估在基线和 12 周干预结束时进行。纳入标准：3-6 岁儿童，经两名专科医生根据《精神障碍诊断与统计手册》第五版（DSM-5）诊断为 ASD。排除标准：严重胃肠道症状、先天性心脏病、肝肾疾病、癫痫、脑畸形、服用抗精神病药物，以及既往 / 当前使用叶酸相关药物或影响叶酸代谢的药物（如维生素 / 矿物质补充剂）。此外，排除线粒体疾病、其他遗传代谢障碍及严重精神 / 神经疾病患者。所有参与者法定监护人入组前签署知情同意书。研究期间 4 人失访，包括对照组 3 人（2 人因家长撤回同意，1 人因搬家）和干预组 1 人（因家长撤回同意）。研究详细流程图见图 1。
2.2. 干预措施干预组参与者每天口服 2 mg/kg 亚叶酸（广东岭南制药有限公司，韶关，中国），最大剂量 50 mg / 天，分两次服用，间隔 6-8 小时，持续 12 周。亚叶酸剂量基于先前发表的双盲安慰剂对照随机临床试验结果，该试验证实了其在 ASD 儿童中的有效性和安全性 [11,14]。超过 5 mg / 天的亚叶酸剂量通常被归类为高剂量 [27]。亚叶酸可直接吞服，或碾碎后与食物 / 饮料混合服用。通过收集家长反馈和药丸计数监测干预依从性。
此外，干预组和对照组均接受基于自闭症及相关沟通障碍儿童治疗与教育（TEACCH）框架的 12 周综合康复教育干预。TEACCH 是专为 ASD 儿童设计的多维度治疗教育项目，采用个性化和结构化教学策略，以增强认知功能、社交沟通能力和适应行为 [28]。该项目通过半天课堂培训模式实施，整合七个核心模块：（1）结构化教学，（2）音乐疗法，（3）艺术活动，（4）语言与认知训练，（5）互动社交游戏，（6）日常生活技能培养，（7）感觉统合治疗。
2.3. 结局测量本研究使用《心理教育档案》第三版（PEP-3）评估亚叶酸干预效果。PEP-3 是评估 ASD 干预效果的成熟工具，可准确全面地评估和监测 6 个月至 7 岁 ASD 儿童的发育情况 [29,30]。PEP-3 包含 172 个项目，分为 10 个子测试，包括 3 个沟通能力综合测试、3 个运动能力综合测试和 4 个适应不良行为综合测试 [29]。评估由两名独立的专业人员进行，他们未参与研究、对分组不知情，但接受过 PEP-3 专项培训并具备相关经验。在此评估中，原始分数越低表示自闭症特征水平越高。基线和 12 周干预后的 PEP-3 克隆巴赫 α 系数分别为 0.96 和 0.97。
2.4. 不良反应采用治疗 emergent 症状量表（TESS）监测高剂量亚叶酸补充的不良反应 [31]。若参与者监护人撤回同意，或干预期间出现睡眠困难、失眠、多动、烦躁或异常神经检查结果等不良反应，则退出研究。
2.5. 基因分型干预组采用聚合酶链反应（PCR）和桑格测序技术对 MTHFR C677T（A222V，rs1801133）、MTHFR A1298C（E429A，rs1801131）、MTR A2756G（D919G，rs1805087）和 MTRR A66G（I22M，rs1801394）进行基因分型 [19,32]。该方法因其高可靠性和准确性被视为金标准 [33]。基线时采集受试者外周血样本，使用磁性通用基因组 DNA 试剂盒（DP705，天根生化科技有限公司，北京，中国）提取基因组 DNA。引物使用 Primer Premier 5.0 设计，由上海迈普生物科技有限公司合成。
PCR 扩增反应体系和程序设置见补充材料表 S1 和 S2。PCR 产物使用 E.Z.N.A. 凝胶提取试剂盒（D2500-01，Omega Bio-Tek，美国佐治亚州诺克罗斯）按制造商说明纯化。测序在 ABI 3730XL 测序仪上进行，使用荧光标记双脱氧核苷酸生成色谱图，分析确定基因型。叶酸代谢基因分型的引物序列、PCR 产物长度及分型结果总结见补充材料表 S3 和 S4。叶酸代谢途径中 MTHFR、MTR 和 MTRR 基因的位置见图 S1。
2.6. 统计分析采用描述性统计总结 ASD 受试者的基线人口学和临床特征。连续变量以均值 ± 标准差（SD）表示，组间差异采用 t 检验；分类变量以频率和百分比报告，因某些亚组样本量较小，组间比较采用 Fisher 精确检验。使用 χ² 检验评估不同基因型频率的 Hardy-Weinberg 平衡 [21]。
独立样本 t 检验用于评估高剂量亚叶酸干预在中国 ASD 儿童中的疗效 [34]。线性混合效应模型用于考察独立基因多态性（MTHFR C677T、A1298C、MTR A2756G、MTRR A66G）与结局变量（PEP-3 评分）随时间的变化关系 [35]。每个结局变量分别拟合模型，报告多态性 - 时间交互作用效应、95% 置信区间（CI）和 p 值。此外，线性回归模型用于探讨不同基因型组合与亚叶酸干预疗效的关联。所有分析均调整以下协变量：各结局变量基线评分、入组年龄、种族、早产、出生体重、分娩方式、父母生育年龄、父母教育水平，以及自闭症行为量表（ABC）和儿童自闭症评定量表（CARS）得分。分析使用 R（版本 4.4.1）进行，p<0.05 视为具有统计学意义。
3. 结果3.1. 自闭症儿童基线特征如表 1 所示，干预组 49 名、对照组 27 名参与者完成试验并纳入最终分析。两组入组平均年龄相当（51.30±12.94 个月 vs. 51.27±9.75 个月；p=0.991）。对照组与干预组在出生体重（p=0.041）和母亲教育水平（p=0.027）上存在显著差异。性别、种族、早产、分娩方式、父母生育年龄、父亲教育水平、ABC 和 CARS 评分在两组间无显著差异（均 p>0.05）。
注：连续变量以均值（SD）表示，组间比较采用 t 检验；分类变量以频率（%）表示，组间比较采用 Fisher 精确检验；缩写：ABC，自闭症行为量表；CARS，儿童自闭症评定量表。
3.2 高剂量亚叶酸干预在中国自闭症儿童中的安全性和有效性表 2 比较了基线和 12 周时的评分，以及干预组和对照组在各个子测试和综合测量中的评分变化。总体而言，两组在组内从基线到 12 周的大多数测量中均显示出改善。干预组在社会互惠性子测试中表现出显著优势。该子测试显示组间存在统计学显著差异，干预组的平均变化为 1.53（标准差 = 1.98），而对照组为 0.33（标准差 = 1.71）（平均差异 = 1.20，95% 置信区间：0.29, 2.10；p=0.010）。此外，本试验中的高剂量亚叶酸补充剂在自闭症儿童中耐受性良好，观察期间未报告显著不良反应。
* 表示统计学显著差异（p<0.05）
3.3 单个叶酸代谢基因多态性与亚叶酸疗效的关联四种多态性基因型的分布符合 Hardy-Weinberg 基因平衡（补充材料，表 S5）。干预组中 MTHFR A1298C、MTHFR C677T、MTR A2756G 和 MTRR A66G 基因多态性的性别差异不显著（所有 p>0.05）（补充材料，表 S6）。基线时，携带 MTHFR A1298C（AC/CC）变异的 ASD 儿童社会互惠评分较低，携带 MTR A2756G（AG）变异的儿童大运动和运动综合评分低于野生型，而其他位点的野生型与变异型之间未发现显著差异（补充材料，表 S7）。
调整所有协变量后的线性混合模型结果显示，携带 MTHFR A1298C 变异（AC/CC）的儿童在多个领域表现出比野生型基因型更大的改善，包括视动模仿增加 1.46 分，社会互惠增加 1.63 分，沟通综合得分增加 1.20 分，运动综合得分增加 3.86 分。值得注意的是，突变组的视动模仿、社会互惠以及沟通和运动综合得分最初低于野生型。经过三个月的干预后，突变组的沟通和运动综合得分超过了野生型（表 3 和图 2a-d）。此外，携带 MTRR A66G 变异（AG/GG）的儿童在认知言语 / 前语言和表达语言方面也比野生型基因型的儿童有更大的改善，分别增加了 2.59 分和 2.76 分（表 3 和图 2e、f）。
注：根据各结局变量的基线评分、入组年龄、种族、早产、出生体重、分娩方式、父亲生育年龄、母亲生育年龄、父亲教育水平、自闭症行为量表（ABC）和儿童自闭症评定量表（CARS）评分进行调整。*p<0.05，**p<0.01
3.4 叶酸代谢基因多态性组合与疗效的关联与 MTHFR C677T 和 MTHFR A1298C 的野生型组合相比，携带 MTHFR 677CC 和 MTHFR 1298 AC/CC 基因型的参与者在沟通（β=2.38，95% CI：0.24, 4.51；p=0.030）和运动（β=6.33，95% CI：1.77, 10.89；p=0.008）的综合评分中表现出显著的正向影响。携带 MTHFR 677 CT/TT 和 MTHFR 1298AA 基因型的参与者在特征性言语行为（β=2.45，95% CI：0.45, 4.45；p=0.018）和适应不良行为的综合评分（β=3.96，95% CI：0.39, 7.52；p=0.031）方面也表现出显著的正向影响。此外，携带 MTHFR 677 CT/TT 和 MTHFR 1298 AC/CC 基因型的参与者在运动（β=6.07，95% CI：0.17, 11.97；p=0.044）和适应不良行为（β=6.52，95% CI：0.99, 12.06；p=0.022）的综合评分中也表现出显著的正向影响。同样，携带 MTHFR 1298 AC/CC 和 MTRR 66AA 基因型的参与者在精细运动（β=2.54，95% CI：0.10, 4.97；p=0.042）和运动综合评分（β=5.28，95% CI：1.27, 9.29；p=0.012）方面比携带 MTHFR A1298C 和 MTRR A66G 野生型组合的参与者表现出更显著的改善。此外，携带 MTR 2756 AA 和 MTRR 66AG/GG 基因型的参与者在表达语言方面表现出显著的正向影响（β=2.81，95% CI：0.05, 5.56；p=0.046）（补充材料，表 S8）。
4. 讨论本研究表明，为期 12 周的高剂量亚叶酸干预可改善 ASD 儿童的社会互惠行为。此外，试验中的亚叶酸补充剂在 ASD 儿童中耐受性良好，观察期间未报告显著不良反应。这些关于亚叶酸干预对 ASD 儿童潜在益处的发现与其他国家的几项研究结果一致 [11,16,36]。例如，在美国 [11] 和法国 [16] 进行的随机对照试验表明，高剂量亚叶酸可显著减轻自闭症症状的严重程度。新加坡的一项开放标签试验也报告称，补充亚叶酸后，ASD 儿童在社交互动和表达语言方面有更大改善 [37]。亚叶酸与利培酮或甲钴胺等其他药物联合作为辅助治疗时，也被证明可改善不恰当言语、多动和适应行为等症状 [14,15]。此外，与言语治疗相比，亚叶酸治疗 ASD 显著节省成本，效果相当且不良反应发生率低 [6]。然而，一项开放标签研究未观察到高剂量亚叶酸补充后的显著改善 [38]，这可能与样本量较小（n=12）和 ASD 受试者年龄较大（13-19 岁）有关。研究表明，较年轻的 ASD 儿童在接受亚叶酸补充后核心症状改善程度更高，可能是由于早期发育阶段神经可塑性更强 [39]。未来需要大规模纵向研究确定是否存在关键发育窗口期，在此期间补充亚叶酸可能产生最大治疗效益。
本研究结果还发现，携带 MTHFR A1298C 突变（AC/CC 基因型）的儿童在接受亚叶酸干预后，在多个发育领域（包括视动模仿、社会互惠、沟通和运动技能）的改善显著优于野生型基因型。此外，携带 MTRR A66G 突变（AG/GG 基因型）的儿童在认知言语 / 前言语和表达语言技能方面也比野生型基因型有更大改善。亚叶酸治疗反应更好的潜在机制可能涉及以下生物途径：MTHFR A1298C 和 MTRR A66G 突变均可降低其编码酶的活性，导致叶酸代谢受损、同型半胱氨酸水平升高和 DNA 低甲基化 [22-24]。这些变化通过损害核苷酸合成、增加氧化应激和神经炎症以及改变基因表达调控来干扰神经发育，而这些也是 ASD 的已知病理机制 [40]。高剂量亚叶酸干预可显著提高 5,10 - 亚甲基四氢叶酸浓度，在 MTHFR 酶活性受损的情况下，这可增加 5 - 甲基四氢叶酸水平并增强叶酸代谢。此外，研究表明，叶酸水平可能显著影响多态性酶的稳定性 [25]。例如，在较高的细胞内叶酸水平下，叶酸分子可通过维持 MTHFR 蛋白的三维结构使其保持适当且完全功能的形式，从而减轻热不稳定形式并抵消酶活性的降低 [41]。本研究中，ASD 患者中 MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTR A2756G 和 MTRR A66G 的突变频率分别为 59.18%、32.65%、24.49% 和 44.90%，与中国人群先前研究结果相似 [42,43]。值得注意的是，这些基因型在中国人群中的分布与其他国家不同：中国人群中 MTHFR C677T 和 MTRR A66G 突变的患病率显著更高，而 MTHFR A1298C 和 MTR A2756G 突变在其他国家更为常见 [19,44]。这些差异可能导致不同的基线叶酸代谢谱，进而对亚叶酸补充剂产生不同反应。
本研究表明，叶酸代谢基因多态性的特定组合显示出更好的治疗效果。例如，与野生型基因型组合相比，MTHFR 677 CC 和 1298 AC/CC 基因型的儿童在沟通和运动综合评分中表现出显著更大的改善，而 MTHFR 677 CT/TT 和 1298 AA 或 1298 AC/CC 基因型的儿童在特征性言语行为、运动综合评分和适应不良行为方面表现出显著更大的改善。这可能是由于叶酸代谢基因多态性的协同效应，这些多态性共同增加了叶酸代谢障碍、同型半胱氨酸水平升高和 DNA 低甲基化的风险，从而导致对亚叶酸补充剂的不同反应 [21,25]。研究表明，携带 MTHFR C677T 和 A1298C 复合杂合突变的个体比仅携带单个突变的个体表现出更高的血浆同型半胱氨酸水平、更低的血浆叶酸水平和 DNA 低甲基化 [25]。携带 MTHFR 677TT 和 1298 AA 基因型的个体同型半胱氨酸水平最高、血浆叶酸水平最低且 DNA 甲基化最低 [23]。因此，高剂量亚叶酸干预可通过缓解单个或联合叶酸代谢基因突变引起的异常叶酸代谢，促进更好的神经发育结局。
本研究具有以下优势：首先，据我们所知，这是首次在中国评估高剂量亚叶酸干预对 ASD 儿童的安全性和有效性，为以往研究中被忽视的人群提供了宝贵见解。其次，研究评估了单个和组合叶酸代谢基因多态性与治疗反应的关联，提供了遗传因素与疗效关系的更全面理解。这些结果表明，携带特定叶酸代谢基因型的儿童可能从高剂量亚叶酸补充剂中获益更多，支持基于基因型的治疗策略的合理性。随着基因检测变得越来越普及和经济实惠，将基因分型纳入常规临床实践正成为为 ASD 提供更精准有效干预的可行策略。未来研究应在更大队列中验证这些基因型与治疗反应的关联，为循证临床决策提供依据。第三，使用经过验证的发育评估工具（PEP-3）使得能够全面评估亚叶酸干预的有效性。然而，本研究存在若干局限性：首先，开放标签设计可能引入偏差，尽管本研究倾向于采用客观的 PEP-3 评估而非父母报告的测量方法，且评估由两名对分组不知情的独立专业人员进行。其次，干预组某些基因型的小样本量以及对照组缺乏基因型数据可能削弱因果推断的强度。此外，本研究未进行多重检验统计校正，可能导致假阳性结果。未来研究应采用双盲、安慰剂对照设计，增加样本量，并进行长期随访，以增强研究结果的可靠性和普遍性。
5. 结论总之，高剂量亚叶酸可改善 ASD 儿童的社会互惠行为，其效果与叶酸代谢基因多态性有关。高剂量亚叶酸干预可能通过缓解由单个或多个叶酸代谢基因突变引起的叶酸代谢异常，促进更好的神经发育结果。未来研究应关注遗传因素与治疗反应之间的关系，旨在通过精准医疗策略为 ASD 儿童提供更有效的治疗干预。
补充材料
· 表 S1：PCR 扩增反应体系
· 表 S2：PCR 程序设置
· 表 S3：叶酸代谢基因分型的引物序列及 PCR 产物长度
· 表 S4：MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTR A2756G 和 MTRR A66G 多态性基因分型结果总结
· 表 S5：叶酸代谢基因多态性的哈迪 - 温伯格平衡检验结果（n=49）
· 表 S6：干预组中自闭症谱系障碍儿童的基线特征
· 表 S7：野生型与突变型基因型在各变量上的基线评分比较
· 表 S8：叶酸代谢基因多态性对干预反应的综合影响
作者贡献· 张彩云（C.Z.）：开展研究、收集数据、进行分析并撰写手稿
· 陈艳林（Y.C.）：收集数据、参与分析并修订手稿
· 侯芳（F.H.）、李艳芝（Y.L.）、王万欣（W.W.）、郭兰（L.G.）、张彩霞（C.Z.）：支持数据分析、参与数据解读并修订手稿
· 李丽（L.L.）、陆慈勇（C.L.）：设计研究并监督项目
· 所有作者：阅读并批准最终手稿
资助本研究得到国家重大专项（项目编号：2024YFC2707801）、深圳市罗湖区软科学项目（项目编号：LX202302122）和深圳市科技创新委员会（项目编号：JCYJ20230807143800002）的支持。
机构审查委员会声明本试验遵循《赫尔辛基宣言》，并于 2018 年 3 月 1 日获得深圳市罗湖区妇幼保健院机构审查委员会和伦理委员会的批准（批准号：ChiCTR2100050018）。
知情同意声明所有参与研究的受试者均获得知情同意。
数据可用性声明手稿中描述的数据、代码手册和软件可通过电子邮件向通讯作者索取。
致谢作者衷心感谢所有自闭症儿童及其家庭对本研究的宝贵参与和承诺。
利益冲突作者声明无利益冲突。资助者在研究设计、数据收集、分析、解释、手稿撰写及提交发表的决策过程中未发挥任何作用。
缩略语表 | |
| 自闭症行为检查表（Autism Behavior Checklist） |
| 自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder） |
| 儿童自闭症评定量表（Childhood Autism Rating Scale） |
| 亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolate Reductase） |
| 蛋氨酸合成酶（Methionine Synthase） |
| 蛋氨酸合成酶还原酶（Methionine Synthase Reductase） |
| 《心理教育档案》第三版（Psycho-Educational Profile, Third Edition） |
| 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction） |
| 随机对照试验（Randomized Controlled Trial） |
参考文献[1] 王世宏，张红涛，邹玉英，等。早期丹佛模式在中国自闭症谱系障碍幼儿中的疗效及调节因素：一项纵向研究 [J]. 世界儿科杂志，2023, 19: 741-752.
[2] Shaw, K.A. 4 岁儿童自闭症谱系障碍的早期识别 - 自闭症和发育障碍监测网络，美国 11 个地点，2020 [J]. MMWR Surveill Summ, 2023, 72: 1-15.
[3] 王思，邓红，尤晨，等。中国自闭症谱系障碍儿童的性别差异在诊断和临床表型中的表现 [J]. 神经科学通报，2017, 33: 153-160.
[4] Dudley, C., Emery, J.C.H. 照顾者时间的价值：支持和照顾自闭症谱系障碍个体的成本 [J]. 2014.
[5] 赵一，陆飞，王翔，等。中国自闭症谱系障碍伴或不伴智力障碍的经济负担：一项全国性的疾病成本研究 [J]. 亚洲精神病学杂志，2024, 92: 103877.
[6] Frye, R.E., Rossignol, D.A., Scahill, L., 等。自闭症谱系障碍中叶酸代谢异常的治疗 [J]. 儿科神经学研讨会，2020, 35: 100835.
[7] Frye, R.E., Rossignol, D.A. 自闭症谱系障碍相关生物医学异常的治疗 [J]. 前沿儿科，2014, 2: 66.
[8] Sobral, A.F., Cunha, A., Silva, V., 等。揭示叶酸依赖的一碳代谢在癌症和神经退行性疾病中的治疗潜力 [J]. 国际分子科学杂志，2024, 25: 9339.
[9] Lam, N.S.K., Long, X.X., Li, X., 等。叶酸及其衍生物在治疗精神疾病中的潜在应用：系统综述 [J]. 生物医学药理学，2022, 146: 112541.
[10] Vasconcelos, C., Schweigert Perry, I., Gottfried, C., 等。叶酸与自闭症：最新证据 [J]. 营养神经科学，2025, 28: 273-307.
[11] Frye, R.E., Slattery, J., Delhey, L., 等。叶酸改善自闭症儿童的语言交流：一项随机双盲安慰剂对照试验 [J]. 分子精神病学，2018, 23: 247-256.
[12] James, S.J., Melnyk, S., Jernigan, S., 等。自闭症儿童的代谢内表型及相关基因型与氧化应激有关 [J]. 美国医学遗传学杂志 B 神经精神病学遗传学，2006, 141B: 947-956.
[13] James, S.J., Cutler, P., Melnyk, S., 等。自闭症儿童氧化应激增加和甲基化能力受损的代谢生物标志物 [J]. 美国临床营养杂志，2004, 80: 1611-1617.
[14] Batebi, N., Moghaddam, H.S., Hasanzadeh, A., 等。水杨酸作为自闭症儿童不适当言语治疗的辅助疗法：一项双盲安慰剂对照随机试验 [J]. 儿童精神病学与人类发展，2021, 52: 928-938.
[15] Frye, R.E., Melnyk, S., Fuchs, G., 等。甲基钴胺素和叶酸治疗自闭症儿童适应行为的效果与谷胱甘肽氧化还原状态有关 [J]. 自闭症研究与治疗，2013, 2013: 609705.
[16] Renard, E., Leheup, B., Guéant-Rodriguez, R.-M., 等。水杨酸改善了 EFFET 安慰剂对照随机试验中自闭症评分 [J]. 生物化学，2020, 173: 57-61.
[17] Pu, D., Shen, Y., Wu, J. MTHFR 基因多态性与自闭症谱系障碍风险之间的关联：一项荟萃分析 [J]. 自闭症研究，2013, 6: 384-392.
[18] Tisato, V., Silva, J.A., Longo, G., 等。自闭症谱系障碍中一碳代谢途径的遗传学与表观遗传学：性别特异性脑表观基因组？[J]. 基因，2021, 12: 782.
[19] Mohammad, N.S., Jain, J.M.N., Chintakindi, K.P., 等。叶酸代谢途径中的异常及自闭症易感性的改变 [J]. 精神病学遗传学，2009, 19: 171.
[20] Ni, W., Li, H., Wu, A., 等。中国人群中三种叶酸相关酶基因的遗传多态性与男性不育缺乏关联 [J]. 辅助生殖与遗传学杂志，2015, 32: 369-374.
[21] 李伟翔，戴思超，郑建建，等。同型半胱氨酸代谢基因多态性（MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTR A2756G 和 MTRR A66G）共同增加叶酸缺乏的风险 [J]. 营养素，2015, 7: 6670-6687.
[22] Frosst, P., Blom, H.J., Milos, R., 等。血管疾病的一个候选遗传风险因素：甲基四氢叶酸还原酶中的常见突变 [J]. 自然遗传学，1995, 10: 111-113.
[23] Liu, X., Solehdin, F., Cohen, I.L., 等。人群和家庭研究将 MTHFR 基因与单纯性家族中的特发性自闭症联系起来 [J]. 自闭症发展障碍杂志，2011, 41: 938-944.
[24] van der Put, N.M.J., Gabreels, F., Stevens, E.M.B., 等。甲基四氢叶酸还原酶基因中的第二个常见突变：神经管缺陷的额外风险因素？[J]. 美国人类遗传学杂志，1998, 62: 1044-1051.
[25] De Mattia, E., Toffoli, G. C677T 和 A1298C MTHFR 多态性，对抗叶酸和氟嘧啶类药物治疗个性化治疗的挑战 [J]. 欧洲癌症杂志，2009, 45: 1333-1351.
[26] Schmidt, R.J., Tancredi, D.J., Ozonoff, S., 等。母体围受孕期叶酸摄入与自闭症谱系障碍及发育迟缓风险的对照研究 [J]. 美国临床营养杂志，2012, 96: 80-89.
[27] Adams, J.B., Bhargava, A., Coleman, D.M., 等。自闭症谱系障碍营养补充剂效果的评价：全国调查结果 [J]. 个人医学杂志，2021, 11: 878.
[28] Fletcher-Campbell, F. 自闭症和相关沟通障碍儿童（TEACCH）的治疗与教育 [M]. 国家教育研究基金会，2003.
[29] Schopler, E., Lansing, M.D., Reichler, R.J., 等。心理教育档案检查手册 [M]. Pro-Ed Inc., 2005.
[30] Ghanatghestani, L.M., Ahmadi, M.S., Tajali, P. 测试和工具在自闭症谱系障碍儿童准确诊断和严重程度中的作用 [J]. 应用家庭治疗杂志，2024, 5: 76-83.
[31] Nilsson, M.E., Koke, S.C. 用医学监管活动词典（MedDRA）定义治疗后出现的不良事件 [J]. Drug Inf J, 2001, 35: 1289-1299.
[32] Elhawary, N.A. 亚甲基四氢叶酸还原酶基因与自闭症谱系障碍的潜在风险 [M]. 医学与医学研究的新视野，2022.
[33] Montella, A., Cantalupo, S., D’Alterio, G., 等。提高药物遗传学中二氢嘧啶脱氢酶检测的单核苷酸多态性基因分型准确性 [J]. 探索靶向抗肿瘤治疗，2024, 5: 374-383.
[34] Ramaekers, V.T., Sequeira, J.M., DiDuca, M., 等。通过叶酸受体自身免疫和营养紊乱改善婴儿自闭症的预后：一项自我对照试验 [J]. 自闭症研究与治疗，2019, 2019: e7486431.
[35] Bettencourt, C., Garret-Gloanec, N., Pellerin, H., 等。自闭症谱系障碍的基线严重程度和随时间进展与迁移有关：来自法国前瞻性纵向研究的证据 [J]. PLoS ONE, 2022, 17: e0272693.
[36] Panda, P.K., Sharawat, I.K., Saha, S., 等。口服叶酸补充剂对自闭症谱系障碍儿童的疗效：一项随机双盲安慰剂对照试验 [J]. 欧洲儿科杂志，2024, 183: 4827-4835.
[37] Wong, C.M., Tan, C.S., Koh, H.C., 等。富马酸作为儿童自闭症的治疗方法：一项关于安全性和有效性的受试者内开放标签研究 [J]. 国际发展神经科学杂志，2025, 85: e10402.
[38] Bent, S., Chen, Y., McDonald, M.G., 等。使用叶酸钙治疗自闭症谱系障碍（ASD）儿童尿代谢物和行为变化的研究 [J]. 先进神经发育障碍，2020, 4: 241-246.
[39] Rossignol, D.A., Frye, R.E. 自闭症谱系障碍中脑叶叶酸缺乏、叶酸受体 α 自身抗体及亚叶酸（叶酸）治疗：系统回顾与荟萃分析 [J]. 个人医学杂志，2021, 11: 1141.
[40] Barretta, F., Uomo, F., Fecarotta, S., 等。基因检测在甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）缺乏症早期诊断中的贡献：意大利南部参考中心的经验 [J]. 基因，2023, 14: 980.
[41] Ulvik, A., Ueland, P.M., Fredriksen, Å., 等。大规模流行病学研究中甲基四氢叶酸还原酶 677 C > T 和 1298A > C 多态性的功能推断 [J]. 人类遗传学，2007, 121: 57-64.
[42] 赵德，孙晨，杨翔，等。自闭症儿童基因 C677T 和 A1298C 多态性中甲基四氢叶酸还原酶的关联 [J]. 中国学校健康杂志，2013, 34: 52-58.
[43] 郭涛，陈红，刘斌，等。中国汉族人群甲基四氢叶酸还原酶多态性 C677T 与自闭症风险 [J]. 基因检测与分子生物标志物，2012, 16: 968-973.
[44] Haghiri, R., Mashayekhi, F., Bidabadi, E., 等。分析伊朗北部自闭症患者中甲硫氨酸合成酶（Rs1805087）基因多态性 [J]. Acta Neurobiol Exp, 2016, 76: 318-323.
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